Vitrification automatisée de la cryo

Nature Communications volume 13, Numéro d'article : 2985 (2022) Citer cet article

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La rapidité et l’efficacité de la collecte de données et du traitement des images en microscopie cryoélectronique ont augmenté au cours de la dernière décennie. Cependant, les techniques de préparation des échantillons cryogéniques ont pris du retard et des dispositifs de préparation d’échantillons plus rapides et plus reproductibles sont nécessaires. Nous présentons ici un dispositif de vitrification avec une manipulation des échantillons hautement automatisée, ne nécessitant qu’une interaction limitée de l’utilisateur. De plus, l'appareil permet l'inspection de films minces par microscopie optique, puisque l'excès de liquide est éliminé par aspiration au moyen de tubes et non de papier buvard. En combinaison avec le contrôle du point de rosée, cela permet une préparation de films minces de manière contrôlée et reproductible. L’avantage est que la qualité de l’échantillon cryo préparé est caractérisée avant l’acquisition des données de microscopie électronique. L'aspect pratique et les performances du dispositif sont illustrés par des résultats expérimentaux obtenus par vitrification de suspensions de protéines, de vésicules lipidiques, de cellules bactériennes et humaines, suivis d'images par analyse de particule unique, tomographie cryoélectronique et microscopie optique et électronique cryocorrélée.

La cryofixation dans l'eau vitreuse (glace amorphe) par congélation rapide d'échantillons biologiques peut assurer une préservation structurelle presque parfaite d'échantillons biologiques tels que des suspensions de protéines, des virus, des bactéries et des cellules eucaryotes. La cryofixation nécessite un taux de congélation suffisamment élevé (> 100 000 °C/s) pour empêcher la formation de glace (cristaux). En conséquence, l’eau adopte un état transitoire amorphe et métastable, semblable à du verre. Grâce à la vitrification, la structure des protéines et des cellules peut être préservée dans leur environnement hydraté natif jusqu'à la résolution atomique. Les échantillons vitrifiés sont compatibles avec les conditions de vide requises pour la microscopie cryoélectronique (cryo-EM) et peuvent également être étudiés par microscopie optique à cryofluorescence (cryofLM)2. La microscopie optique et électronique corrélative (CLEM)3 réunit les avantages de l'EM (haute résolution, contexte structurel) avec les avantages du large éventail de techniques de microscopie optique disponibles (imagerie en direct, étiquetage polyvalent)4,5.

La vitrification par congélation par plongée à l'aide d'éthane liquide ou d'un mélange éthane/propane comme agent cryogénique6 s'est avérée être une approche pratique pour la cryopréparation d'échantillons biologiques jusqu'à 10 microns d'épaisseur1,7. Pour la cryo-EM, les suspensions purifiées de protéines et de virus sont conservées dans de fines couches d’eau mesurant plusieurs dizaines de nanomètres, à partir desquelles des reconstructions de résolution atomique peuvent être déterminées à l’aide de SPA8,9. Les structures plus grandes, telles que les bactéries et les cellules adhérentes jusqu’à quelques microns d’épaisseur, conviennent également à la vitrification. Les reconstructions tridimensionnelles avec une résolution moléculaire peuvent être déterminées à l'aide de la tomographie cryoélectronique (cryo-ET) d'échantillons jusqu'à environ un demi-micron d'épaisseur10,11. Il est important de minimiser l'épaisseur de la couche liquide car le milieu entourant l'échantillon disperse les électrons, ajoutant au bruit de fond dans les images, réduisant ainsi le rapport signal/bruit dans les images et réduisant la résolution atteignable dans les reconstructions tridimensionnelles résultantes.

L'étape essentielle consistant à générer une fine couche d'échantillon liquide sur un support d'échantillon de microscopie électronique pour l'EM (généralement une couche de carbone trouée supportée par une grille de cuivre de 3,05 mm de diamètre) est problématique, car les fines couches d'eau sont intrinsèquement instables et il faut avoir un contrôle exact sur le L'épaisseur de la couche d'eau est difficile. Il a été constaté que rendre le film support hydrophile par décharge luminescente dans l’air ou dans une alkylamine12,13 aide à former une fine couche liquide sur le film support et qu’un environnement saturé d’humidité aide à stabiliser la fine couche. La pratique courante actuelle consiste à appliquer plusieurs microlitres de solution d’échantillon sur un film support à décharge luminescente, puis à éponger l’excès de liquide à l’aide d’un papier filtre qui est ensuite congelé par plongée14,15.