Rapports scientifiques volume 13, Numéro d'article : 6934 (2023) Citer cet article
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Les percées rapides et récurrentes de nouvelles souches (variantes) du SRAS-CoV-2 ont incité les autorités de santé publique du monde entier à mettre en place des réseaux de surveillance pour surveiller la circulation des variantes préoccupantes. L’utilisation de technologies de séquençage de nouvelle génération a accru la nécessité d’une évaluation du contrôle qualité, comme l’exigent les laboratoires cliniques. La présente étude est la première à proposer un guide de validation pour le typage du SRAS-CoV-2 utilisant trois méthodes NGS différentes répondant aux normes ISO15189. Celles-ci incluent l'évaluation du risque, de la spécificité, de l'exactitude, de la reproductibilité et de la répétabilité des méthodes. Parmi les trois méthodes utilisées, deux sont basées sur des amplicons impliquant une réaction en chaîne par polymérase à transcription inverse (Artic v3 et Midnight v1) sur Oxford Nanopore Technologies, tandis que la troisième est basée sur des amplicons utilisant une réaction en chaîne par polymérase à complément inverse (Nimagen) sur la technologie Illumina. Nous avons constaté que toutes les méthodes répondaient aux exigences de qualité (par exemple, des résultats de typage 100 % concordants en termes d'exactitude, de reproductibilité et de répétabilité) pour le typage du SRAS-CoV-2 en milieu clinique. De plus, les résultats de typage issus de chacune des trois méthodes de séquençage ont été comparés à l'aide de trois nomenclatures largement connues (OMS, Pangolineage et Nextclade). Ils ont également été comparés en ce qui concerne les variations d'un seul nucléotide. Les résultats ont montré qu'Artic v3 et Nimagen devraient être privilégiés pour les enquêtes sur les épidémies, car ils fournissent des résultats de meilleure qualité pour les échantillons qui ne répondent pas aux critères d'inclusion pour une analyse en milieu clinique. Cette étude est une première étape vers la validation des tests NGS développés en laboratoire dans le contexte de la nouvelle réglementation européenne relative aux dispositifs médicaux et aux diagnostics in vitro.
Les coronavirus sont des virus à ARN simple brin enveloppés largement répandus parmi les mammifères et les oiseaux et qui provoquent un large éventail de maladies, notamment des infections respiratoires. Ces virus présentent une grande diversité génétique et une grande capacité à réaliser des recombinaisons et des mutations génétiques1,2. Fin 2019, un nouveau membre de la sous-famille des coronavirus, nommé SARS-CoV-2, a été détecté pour la première fois en Chine (Wuhan) et est devenu responsable de la pandémie mondiale sans précédent qui a suivi. Malgré sa faible fréquence de mutation par rapport aux autres virus à ARN3, le taux de transmission élevé du SRAS-CoV-2 chez l’homme augmente les chances d’acquisition de mutations et d’évolution ultérieure. Par conséquent, de nombreuses variantes du SRAS-CoV-2 sont apparues au fil du temps, notamment des variantes intéressantes et des variantes préoccupantes (VOC). Cette dernière présente une transmissibilité et/ou une capacité à échapper à l’immunité plus élevée que les souches en circulation auparavant3,4,5,6.
La plupart des pays ont tenté de contrôler les nouvelles vagues d’infection en mettant en œuvre des mesures de santé publique dans le but d’éviter l’inondation des établissements de santé, garantissant ainsi l’accès aux soins aux personnes ayant besoin de soins essentiels. Dans ce contexte, il était essentiel de développer un réseau de surveillance efficace permettant la détection précoce des nouveaux variants circulants et leur transmission dans la population7,8. Le séquençage du génome entier aide non seulement les scientifiques à étudier le virus et à développer des vaccins, mais constitue également un outil clé pour établir de solides réseaux de surveillance.
L'intégralité du génome du SRAS-CoV-2 a été séquencé pour la première fois début 2020 à l'aide de cellules infectées par le virus et en combinant plusieurs technologies de séquençage de nouvelle génération (NGS) (c'est-à-dire Illumina et Oxford Nanopore Technologies)9. Les deux technologies sont encore largement utilisées dans le monde pour obtenir des séquences de souches en circulation5,6,7,10,11. En septembre 2020, le réseau national de séquençage du Royaume-Uni, appelé Coronavirus Disease 2019 (COVID-19) Genomics UK Consortium, a identifié le premier COV connu aujourd'hui sous le nom de variante alpha (B.1.1.7). Cette variante du SRAS-CoV-2 est caractérisée par la délétion HV69-70 et la mutation de l'acide aminé N501Y. Elle était capable de se propager très rapidement et présentait un total de 14 remplacements d'acides aminés spécifiques à la lignée par rapport à la première souche identifiée à Wuhan, dont trois mutations connues pour conférer des avantages épidémiologiques (c'est-à-dire N501Y, délétion 69-70, P681H)7,12. . Depuis lors, quatre principales variantes préoccupantes ont été identifiées dans le monde : la version bêta (K417N, E484K), la gamma (K417T, V1176F), la delta (L19R, L452R, délétion 157-158, L452R, T478K, D950N) et la dernière variante omicron. (R346K, L452X, F486V). Chacune de ces variantes a accumulé des mutations leur conférant des avantages évolutifs jusqu'aux variantes omicrons actuellement les plus répandues qui ont acquis plus de 60 mutations par rapport au génome de référence de Wuhan6,13,14.
25. 40 \(\upmu\)L of each pool diluted with 60 \(\upmu\)L of RC-PCR Low-TE buffer (Nimagen B.V.; Nijmegen, Netherlands) was purified using 85 \(\upmu\)L of Solid Phase Reversible Immobilization (SPRI) AmplicleanTM magnetic beads (Nimagen B.V.; Nijmegen, Netherlands) by mixing DNA and beads (beads:DNA ratio = 0.85), followed by incubation of the mix at room temperature (RT) for 5 min, then beads were washed twice with 75% ethanol. Beads covered with DNA fragments of interest were mixed with 110 \(\upmu\)L of RC-PCR Low TE Buffer (Nimagen B.V.; Netherlands) and incubated at RT for 2 min. The purification procedure was repeated a second time. Eluted DNA from each pool was quantified using the 1xdsDNA HS kit (Thermo Fisher Scientific; MA, USA) with the Qubit 4.0 (Thermo Fisher Scientific; MA, USA) and amplicons size and integrity were checked using the QIAxcel fragment analyzer (Qiagen; Hilden, Germany) with the DNA Screening Kit (Qiagen; Hilden, Germany)./p>9) and their length (Artic: minimum length= 400 bp - maximum length= 700 bp, Midnight: minimum length= 600 bp - maximum length= 1,200 bp) to avoid chimeric reads. The passed reads were mapped to the reference genome of SARS-CoV-2 MN908947.3 using minimap2 (version 2.18-r1015) and SNVs were called for positions with depth of reads \(\ge\) 20, and consensus sequence obtained using medaka (version 1.4.3, model r941_prom_variant_g360) a software using trained neural network-based models to appropriately call sequence variations29./p> 0.81 for SNV identification./p> 0.81 for SNV identification./p> 100x, run 2: mean coverage= 0x, 0% > 100x, run 3: mean coverage= 5x, 1.5% > 100x)./p> 0.8) for all samples with a qPCR Ct value < 25 (Artic v3: mean \(\kappa\) = 0.9918 ± 0.01060, Midnight v1: mean \(\kappa\) = 1 ± 0, Nimagen: mean \(\kappa\) = 0.9433 ± 0.1468). For the sample with the highest qPCR Ct value (Ct = 29.01), coefficients are lower (Artic v3: \(\kappa\) = 0.6896 ± 0.02007, Midnight v1: \(\kappa\) = 0 ± 0.00005, Nimagen: \(\kappa\) = 0.7659 ± 0.05119) indicating a greater discrepancy, especially for the Midnight v1 SOP. Both short-amplicon methods (Artic v3 and Nimagen) have a coefficient indicating a high correlation (Fig. 1 left panel). Although the reproducibility of the three methods is similar for samples with a qPCR Ct value <25, the reproducibility of the Midnight v1 SOP is significantly different from that of both other methods for samples with a qPCR Ct value >25 (Supplementary table 3)./p> 100x, repeat 2: mean coverage= 0x, 0% > 100x, repeat 3: mean coverage= 1x, 0% > 100x) (Supplementary table 4)./p> 25 (Artic v3: \(\kappa\) = 0.7279 ± 0.08269, Midnight v1: \(\kappa\) = 0 ± 0, Nimagen: \(\kappa\) = 0.8837 ± 0.03753) still showing a high repeatability for Nimagen and Artic while Midnight v1 is not repeatable./p>25 (Artic v3: \(\kappa\) = 0.7581 ± 0.01951, Nimagen: \(\kappa\) = 0.8287 ± 0.01903), especially for the Midnight v1 SOP which had a \(\kappa\) coefficient = 0 ± 0.00003, indicating that it was not repeatable for samples with a qPCR Ct value > 25 (Fig. 1 right panel). This was due to the low read depth (<20) at most nucleotide positions for two repeats performed with the Midnight v1 SOP. As this depth was the minimum threshold set in the bio-informatics pipeline for nucleotide calling in the consensus sequence, and as the third repeat had a sufficient read depth at these positions, the analysis resulted in a complete mismatch. Although the repeatability is not significantly different between the three methods for samples with qPCR Ct value <25, the repeatability of the Midnight v1 SOP is significantly different when compared with both other methods for qPCR Ct value >25 (Supplementary table 3)./p> 25 in clinical setting, sequencing results and strain typing can be obtained in non-clinical setting but should be interpreted with caution. Therefore, we compared the three methods using fifty-five samples without considering the Ct value exclusion criteria./p>30 for the N-gene (Table 2)./p>25 (Table 2), which led us to study the evolution of genome coverage as a function of viral load. We observed that for the three SOPs, the coverage was high for all samples with a N-gene qPCR Ct values <25 (96% and 90% of samples had a mean coverage above 380x for Artic v3 and Midnight v1 methods, respectively, and 90% of samples have a mean coverage above 600\(\times\) for Nimagen method) but the sequencing coverage dropped drastically with the three SOPs for samples with a qPCR Ct value >25 (Fig. 2)./p>25./p>25, the kappa coefficient decreased progressively with the increase of Ct value. This decrease was similar when comparing any method to one another (Fig. 3). However, all the mismatches observed can be explained by a too low read depth at the position of the mismatch for the method that did not identify the mutation (<20 reads for the Nanopore methods or <5 reads for the Illumina method). When, at that genomic position, the depth of reads was greater than 0 but below the previously mentioned cut-offs, we observed that the mutation was present in more than 70% of the reads, indicating that the discrepancies were not due to sequencing errors inherent to the methods but rather to the detection thresholds set in the bio-informatics pipelines./p>25 usually showed insufficient read depth which provided low reliability on some key mutations, which could lead to wrong or approximate lineage designation, highlighting the importance of sample selection criteria in the context of national surveillance programs using clinical samples8,38. Our data confirmed that the three methods validated here provided similar quality results and were adequate for epidemiological monitoring of SARS-CoV-2 using samples with N-gene qPCR CT value <25 in clinical setting./p>25), a method using smaller amplicons (Artic v3 and Nimagen) should be preferred as they exhibit better reproducibility and repeatability, and a higher mean coverage of the genome. This variability in coverage for samples with a low viral load had already been reported by Freed et al. Nevertheless, they have shown that it was possible to reach good quality results by generating more sequencing data than for samples with high or medium viral loads. This was not achieved in our study as we sequenced all samples under the same conditions. It has also been shown that in order to effectively detect SNVs and by extension reach a minimum coverage of 400x with an amplicon-based NGS technique, the material used for reverse transcription should contain at least 1,000 copies of viral RNA39,40./p>
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