L'ADN mitochondrial est une cible de l'intégration du VHB

Biologie des communications volume 6, Numéro d'article : 684 (2023) Citer cet article

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Le virus de l'hépatite B (VHB) peut s'intégrer dans le génome des cellules infectées et contribuer à l'hépatocarcinogenèse. Cependant, le rôle de l’intégration du VHB dans le développement du carcinome hépatocellulaire (CHC) reste flou. Dans cette étude, nous appliquons une approche de séquençage d’intégration du VHB à haut débit qui permet une identification sensible des sites d’intégration du VHB et l’énumération des clones d’intégration. Nous identifions 3 339 sites d’intégration du VHB dans des échantillons de tissus tumoraux et non tumoraux appariés provenant de 7 patients atteints de CHC. Nous détectons 2 107 intégrations clonées (1 817 dans des tissus tumoraux et 290 dans des tissus non tumoraux) ainsi qu'un enrichissement significatif d'intégrations clonales du VHB dans l'ADN mitochondrial (ADNmt) se produisant préférentiellement dans les gènes de phosphorylation oxydative (OXPHOS) et la région de la boucle D. Nous constatons également que les séquences d'ARN du VHB sont importées dans les mitochondries des cellules d'hépatome avec la participation de la polynucléotide phosphorylase (PNPASE) et que l'ARN du VHB pourrait jouer un rôle dans le processus d'intégration du VHB dans l'ADNmt. Nos résultats suggèrent un mécanisme potentiel par lequel l'intégration du VHB pourrait contribuer au développement du CHC.

L'infection chronique par le virus de l'hépatite B (VHB) est un facteur de risque majeur de développement d'un carcinome hépatocellulaire (CHC). Par rapport aux individus en bonne santé, les patients atteints d'hépatite B chronique (CHB) ont un risque jusqu'à 100 fois plus élevé de développer un CHC, qui est la quatrième cause de décès par cancer dans le monde, avec environ 780 000 décès/an1,2. L'ADN viral intégré a été détecté dans 85 à 90 % des CHC liés au VHB, et sa présence dans les tumeurs qui se développent dans les foies non cirrhotiques des enfants ou des jeunes adultes confirme le rôle de l'intégration de l'ADN viral dans l'hépatocarcinogenèse3,4,5, 6,7. L'intégration de l'ADN du VHB dans le génome de l'hôte peut entraîner une instabilité chromosomique, une mutagenèse par insertion, une dérégulation de l'expression du gène de l'hôte et la production de protéines virales mutantes, telles que des protéines de surface tronquées et HBx aux propriétés oncogènes connues8,9. Bien que les sites d'insertion de l'ADN du VHB semblent être répartis de manière aléatoire dans le génome de l'hôte, l'utilisation récente d'approches de séquençage de nouvelle génération (NGS) a conduit à l'identification de l'enrichissement de l'intégration du VHB dans des gènes spécifiques responsables du cancer, notamment TERT, MLL4, CCNE1 et CCNA2, dans les tissus tumoraux7,10,11,12,13,14,15,16. De plus, une étude récente a montré que des altérations récurrentes du nombre de copies dans les gènes responsables du cancer peuvent être associées à une intégration virale à distance16. Bien qu'un nombre important de cas aient été étudiés, les gènes connus liés au cancer ne sont modifiés par l'intégration du VHB que dans une petite proportion de CHC liés au VHB. De nombreuses études ont également démontré que des éléments génomiques spécifiques, tels que des séquences répétitives, des séquences d'ADN pour les ARN non codants et des rétrotransposons, sont ciblés par l'intégration du VHB7,11,12,14,17,18,19. Une étude menée à Hong Kong qui a analysé des lignées cellulaires de CHC positives pour le VHB a montré que l'expression d'un transcrit chimérique spécifique de HBx-LINE1 avait une fonction de promotion de la tumeur, une grande proportion de CHC évalués exprimant ce transcrit17. Néanmoins, l’expression de HBx-LINE1 n’a pas été confirmée dans une grande série de CHC liés au VHB provenant de patients européens20.

Malgré les progrès de la recherche sur l’intégration de l’ADN du VHB, de nombreux aspects clés restent flous. Dans l'ensemble, le développement de méthodes alternatives de détection pour l'intégration du VHB pourrait aider à mieux comprendre les mécanismes impliqués dans le processus cancérogène induit par l'intégration du VHB.

En appliquant une méthode de séquençage d'intégration du VHB à haut débit (HBIS), dans cette étude, nous avons détecté un enrichissement de l'intégration du virus dans l'ADN mitochondrial (ADNmt) provenant de tissus hépatiques tumoraux et non tumoraux de patients atteints de CHC. De plus, nous avons appliqué HBIS et RNASeq à des mitochondries purifiées à partir de cellules HepAD38 induites par le VHB et détecté de multiples intégrations du VHB dans l'ADNmt ainsi que des transcrits de fusion VHB-mitochondriaux. Toutes les intégrations mitochondriales dans les tissus tumoraux ont été développées par clonage et impliquaient à la fois les gènes mitochondriaux de phosphorylation oxydative (OXPHOS) et la région de la boucle D. Nous avons également découvert que des séquences d'ARN du VHB étaient importées dans les mitochondries des cellules d'hépatome et que la polynucléotide phosphorylase (PNPASE) pourrait être impliquée dans l'importation des transcrits viraux.

15 kb, with more than 20% having a length shorter than 100 bp31,46,55. Considering that mtDNA averages several thousand copies per hepatocyte compared to the two copies of numts in nuclear DNA (nDNA), by isolating mitochondria from cells, it is possible to completely dilute out numts, leading to numt-free mtDNA sequences. Therefore, to study mtDNA HBV integration, we isolated nuclei, cytoplasm, and mitochondria from HBV-producing HepAD38 cells and applied both HBIS and RNASeq. According to HBIS, several HBV integration sites were identified in DNA isolated from mitochondria, whereas no integration was detected in numts from nDNA. Furthermore, RNASeq revealed the presence of chimeric HBV-mitochondrial transcripts within mitochondria but not in cytoplasm or nuclei of HBV-producing HepAD38 cells, and mtDNA insertion sites may be transcriptionally active in these cells. Both HBIS and RNAseq analysis also revealed that MMEJ have a major role in HBV integrations occurring in mitochondrial genomes. Therefore, taken together, our data clearly demonstrate that HBV can integrate into mtDNA of tumour and non-tumour hepatocytes. Some previous studies have reported data concerning HBV integration in mtDNA16,56,57,58,59,60. All these studies have utilised high-throughput HBV genome-enrichment sequencing approaches to study HBV integration, and most of them have analysed hepatoma cell lines stably expressing HBV DNA56,57,58,59.To the best of our knowledge, only one16 of the papers has reported data on HBV integration in mtDNA from human liver tissues. In particular, in the supplementary dataset of this paper, 58 different HBV integration sites in mtDNA from tumour and/or non-tumour liver tissue specimens of 11 patients with HBV-related HCC have been listed16. The mitochondrial genomic regions most frequently targeted by HBV integration in the 11 patients were the D-loop region, ND4, ND5, RNR2, CYTB, ND6, ND1, ND2 and COX3 genes16. HBV integration events have also been described in mtDNA from humanised-liver tissue samples of chimeric mice60. In this study, Furuta et al.60 have identified 50 distinct HBV integration sites in mtDNA from chimeric mice. These integrations (a) have been associated with higher levels of HBV replication, (b) occurred at higher frequency in the D-loop region, and (c) appeared to rely on MMEJ60. No detailed information on virus-mtDNA junctions has been provided in studies performed on PLC/PRF/5 cell lines56,59. However, the fact that HBV integration in mtDNA may occur in these cells—which do not replicate HBV and only express multiple distinct viral RNAs from HBV integrants56,59—suggests that viral RNA might be involved in the process of HBV integration in mtDNA. Despite a number of studies documenting interaction between HBV proteins and mitochondria and consequent alteration of mitochondrial functions61,62,63, whether HBV nucleic acids may translocate into mitochondria has only minimally been addressed. Based on our results, HBV transcripts, but not viral full-length genome or cccDNA, can localise to mitochondria. In addition, PNPASE, a mitochondrial protein considered the first RNA import factor for mammalian mitochondria35,36,39, possibly mediates viral RNA delivery into the mitochondrial matrix. A PNPASE-dependent RNA import sequence that we identified for the preS1 transcript as well as known stem-loop structures specific to HBV transcripts appear to mediate mitochondrial targeting of viral RNAs. Localisation of HBV transcripts to mitochondria leads us to hypothesise that viral RNA may represent a possible substrate for HBV integration in mtDNA. The mitochondrial genome is more prone to damage and double-strand break (DSB) formation than the nuclear genome due to frequent exposure to the ROS generated by mitochondrial oxidative phosphorylation and the lack of protective histones. Considering that several reports have shown that RNA molecules can directly act as a template for the repair of mitochondrial DSBs in human cells64, it is tempting to speculate that viral exploitation of this pathway may lead to HBV sequences being inserted into the mitochondrial genome. In summary, we found that HBV may integrate into mtDNA, with tumours and non-tumour liver tissues showing distinct profiles of viral integration into the mitochondrial genome. Moreover, our results indicate that HBV RNA may be actively imported into mitochondria and that viral RNA sequences might be involved in the process of HBV integration into mtDNA. In spite of the relatively limited sample of patients, this study offers new insight into the HBV-hepatocyte interaction and provides a new basis for investigative analyses that may lead to further comprehension of the mechanisms by which HBV insertion can drive HCC development and progression./p> 5 exo− (5000 U/mL) (New England Biolabs, Ipswich, MA) for 1 h at 37 °C. All reactions were purified by a MinElute Reaction Clean-up kit (Qiagen). Each aliquot of blunted, A-tailed DNA fragments was then ligated to 200 pmol annealed linkers (LinkerTop + LinkerBottom) (Supplementary Table 2) with 4 μL pLinker, 5 μL NEB T4 DNA ligase buffer and 1 μL T4 DNA ligase (2 × 106 U/mL, high concentration) (New England Biolabs) for 1 h at 25 °C and then overnight at 16 °C. The ligase was inactivated by incubation at 70 °C for 20 min, and the reactions were purified using a MinElute Reaction Clean-up kit (Qiagen). Finally, all six reactions were pooled, and the pooled linker-ligated DNA was aliquoted into two equal parts to perform semi-nested ligation-mediated PCR with forward or reverse HBV primers (Fig. 1 and Supplementary Table 2). The forward and reverse enrichment sequences were kept separate throughout the remainder of the protocol. The DNA was divided into 1-µg aliquots; each aliquot was mixed with 20 µL Phusion HF buffer (5×), 3 μL dNTPs (10 mM), 1 μL biotinylated forward (20 μM) or reverse HBV primer (Supplementary Table 2) (2.5 μM), 1 μl Phusion Taq (2000 U/ml) (New England Biolabs) and H2O to 50 μL. Single-primer PCRs were performed as follows: 98 °C for 1 min; 12 cycles of 98 °C for 15 s, 65 °C for 30 s and 72 °C for 45 s; 72 °C for 1 min); and a hold at 4 °C. Each tube was then spiked with 1 μL pLinker (Supplementary Table 2) (2.5 μM) and subjected to additional cycles of PCR, as follows: 98 °C for 1 min; 35 cycles of 98 °C for 15 s, 65 °C for 30 s and 72 °C for 45 s; 72 °C for 5 min; and a hold at 4 °C. Forward and reverse PCRs were purified using the QIAquick PCR purification kit (Qiagen). The purified products were well separated on a 2% agarose gel, and fragments of 300–1000 bp were excised. The DNA was purified using a QIAquick gel extraction kit, and gel-based size selection and purification was repeated once. Then, 100 μL T1 magnetic streptavidin beads (Invitrogen) were added to each forward and reverse PCR product, and the mixture was incubated for 1 h with gentle rocking at room temperature. The beads were magnetically isolated, washed three times in 500 μL 1× B&W buffer (10 mM Tris pH 7.5, 1 mM EDTA, 2 M NaCl) and once in H2O and resuspended in 50 μL H2O. Subsequently, 25 μL of the beads from each of the forward and reverse PCRs were separately mixed with 10 µL Phusion HF buffer (5×), 1.5 μL dNTPs (10 mM), 1 μL forward (20 µM) or reverse MiSeq HBV primer (20 μM), 1 μL forward or reverse MiSeq-pLinker (20 μM) (all MiSeq primers contain an adaptor for Illumina flow cell surface annealing) (Supplementary Table 2), 0.5 μL Phusion Taq (2000 U/mL), and 11 μL H2O and subjected to PCR (98 °C for 1 min, 35 cycles of 98 °C for 10 s, 65 °C for 40 s, and 72 °C–40 s, followed by 72 °C for 5 min and a hold at 4 °C). The PCR products were magnetically separated from the beads and purified using the QIAquick PCR purification kit (Qiagen). The adaptor-ligated fragments were enriched by 25 cycles of PCR with Illumina primers Index 1 and Index 2, as follows: 98 C° for 1 min, 25 cycles of 98 °C for 30 s, 55 °C for 30 s, and 72 °C for 30 s), and 72 C° for 5 min. Forward and reverse libraries for the same sample were mixed in equimolar ratios and sequenced by 250-bp paired-end sequencing using an Illumina MiSeq. A total of 340 integration libraries were constructed from liver tissue samples of the nine individuals analysed (7 patients with HBV-related HCC and 2 HBsAg-negative subjects as a control) and from the PLC/PRF/5, HepAD38 and Vero cell lines./p>

3.0.CO;2-E" data-track-action="article reference" href="https://doi.org/10.1002%2F1097-0142%28195405%297%3A3%3C462%3A%3AAID-CNCR2820070308%3E3.0.CO%3B2-E" aria-label="Article reference 24" data-doi="10.1002/1097-0142(195405)7:33.0.CO;2-E"Article CAS PubMed Google Scholar /p>

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