Détection ultrasensible et visuelle du génotype de norovirus humain GII.4 ou GII.17 à l'aide de CRISPR

Virology Journal volume 19, Numéro d'article : 150 (2022) Citer cet article

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L’intégration de capteurs CRISPR-Cas12a avec une amplification du signal isotherme peut être exploitée pour développer des tests peu coûteux, jetables et ultrasensibles pour le diagnostic des agents pathogènes humains.

Des tests de fluorescence et de bandelette à flux latéral (LFS) en temps réel ou en point final médiés par RT-RAA-Cas12a pour la détection directe du génotype de norovirus (NOV) GII.4 ou GII.17 ont été explorés.

Les résultats ont montré que notre test fluorescent et LFS médié par RT-RAA-Cas12a pouvait détecter NOV GII.4 ou GII.17 en ciblant le gène de la protéine virale 1. Notre test fluorescent et LFS médié par RT-RAA-Cas12a peut détecter spécifiquement NOV GII.4 ou GII.17 sans réactivité croisée avec d'autres virus apparentés. La limite basse de détection pouvait atteindre 0,1 copie/μL en 30 à 40 minutes environ, et les résultats étaient visualisés à l'aide d'un illuminateur à lumière ultraviolette ou sur un LFS sans équipement complexe. De plus, notre test fluorescent et LFS médié par RT-RAA-Cas12a a fourni une alternative visuelle et plus rapide au test RT-PCR en temps réel, avec un accord prédictif positif de 95,7 % et 94,3 % et un accord prédictif négatif de 100 %.

Ensemble, notre approche médiée par RT-RAA-Cas12a aurait un grand potentiel pour le diagnostic au point d'intervention de NOV GII.4 et/ou GII.17 dans des contextes à ressources limitées.

Les norovirus humains (NOV) sont désormais reconnus comme l'une des principales causes de la majorité de toutes les gastro-entérites non bactériennes [1]. Les NOV sont un groupe de virus à ARN qui peuvent provoquer des symptômes tels que des vomissements aigus et de la diarrhée durant généralement 48 heures chez les enfants et les adultes par ailleurs en bonne santé. Les NOV sont hautement infectieux, car même quelques particules peuvent provoquer des maladies, et les individus infectés excrètent de grandes quantités de virus [2, 3]. Les NOV sont principalement transmis aux humains par exposition à des aliments et à de l'eau contaminés suite à un contact direct ou indirect avec des selles humaines infectées par des NOV [4], ou dans des aérosols générés par les vomissements d'individus infectés [5]. En raison du pouvoir infectieux élevé des NOV et de leur capacité de transmission efficace, des épidémies de NOV ont été signalées à l'échelle mondiale dans des milieux communautaires fermés, notamment des hôpitaux et des maisons de retraite, et nécessitent donc des mesures d'intervention pour réduire les infections agressives [6].

Les norovirus humains possèdent une immense diversité génétique avec dix génotypes différents (GI-GX) et au moins 48 génotypes identifiés [7]. Les génogroupes GI, GII et GIV des NOV sont connus pour être associés à l'infection humaine. Parmi environ 21 génotypes du NOV GII, le génotype GII.4 a été responsable de la majorité des cas cliniques d'infection par percée des NOV au cours de la dernière décennie (8). Récemment, un nouveau génotype GII.17 de NOV a émergé et s'est propagé rapidement pour devenir la souche dominante de NOV dans certaines régions d'Asie, posant le risque de nouvelles menaces d'épidémies [9]. Jusqu’à présent, hormis quelques rapports sur un traitement antiviral efficace chez l’homme [10], il n’existe actuellement aucun vaccin NOVs autorisé pour l’homme [11]. En conséquence, une détection plus rapide et plus précoce de l’infection par les NOV joue un rôle important en facilitant une intervention précoce, un traitement et une prévention des infections, ce qui, à son tour, peut atténuer le risque de transmission du virus infectieux.

La référence actuelle pour la détection des NOV repose sur les techniques moléculaires, notamment la réaction en chaîne par polymérase par transcription inverse (RT-PCR), la RT-PCR imbriquée et la RT-PCR en temps réel (12). Parmi ces méthodes, la RT-PCR en temps réel a été largement utilisée pour détecter ou diagnostiquer une infection par NoV en raison de sa sensibilité et de sa spécificité élevées, ainsi que de son faible risque de contamination transmise. Actuellement, divers tests RT-PCR en temps réel disponibles dans le commerce ont démontré la sensibilité de la RT-PCR en temps réel à 10 à 50 copies du génome/réaction pour le NoV GI et à 1 à 300 copies du génome/réaction pour le NoV GII (13). Cependant, la méthode RT-PCR en temps réel repose généralement sur un équipement sophistiqué et un personnel hautement qualifié, et a un temps de réaction moyen d'environ 2 heures, ce qui n'est pas adapté à une utilisation simple, rapide et sur le lieu de soins (POC). ) test moléculaire pour diagnostiquer l'infection par les NOV dans les zones à ressources limitées pour une détection de routine. Dans une étude récente, Sun et al. ont présenté une méthode colorimétrique sur papier pour détecter et distinguer les génotypes GII.4 et GII.17 des NOV (14). Cependant, le test utilisant cette méthode nécessite un temps relativement long (~ 3 h) et la plage de détection est limitée entre 2,6 fM et 0,5 pM, et est donc moins sensible que la RT-PCR [14]. À l'inverse, en raison de l'excellente rapidité, sensibilité et spécificité, le système de détection d'acides nucléiques basé sur des nucléases groupées guidées par ARN, composé de courtes répétitions palindromiques régulièrement espacées (CRISPR) et de leurs nucléases associées à CRISPR (Cas), a récemment montré un potentiel considérable pour exploiter les diagnostics moléculaires POC de nouvelle génération pour les agents pathogènes infectieux [15,16,17]. Actuellement, l'efficacité de plusieurs versions de nucléases Cas, notamment Cas12a, Cas12b, Cas13a et Cas14, a été évaluée dans des tests in vitro et in vivo (18,19,20,21). Parmi ces nucléases, Cas12a (anciennement Cpf1) est une endonucléase de classe II de type V. Cas12a contenant un domaine nucléase RuvC est inauguré par un seul ARN CRISPR (ARNcr) contenant une séquence de motif adjacent à un protospaceur (PAM) riche en T pour cliver l'ADN double brin (ADNdb) sur un site spécifique, ou sans PAM pour effectuer un clivage non spécifique de l'ADNsb en trans in vitro [18]. De plus, la combinaison des nucléases Cas12a avec l'amplification par la recombinase polymérase (RPA) ou la transcription inverse-RPA (RT-RPA) a été étudiée en profondeur pour développer le système DETECTR (DNA Endonuclease-Targeted CRISPR Trans Reporter) et améliore considérablement la sensibilité et la spécificité de la détection des acides nucléiques. 18].